根据标记物的性质，可以将标记物划分为三类：

即标记时无论pH如何，都能得到良好的标记结果，前提是不能破坏胶体金的胶体状态。此类标记物仅仅是通过疏水相互作用与胶体金相结合，如PEG，这也是调节pH时首先要采用PEG保护电极的原因，当然，如果使用的是充胶的电极，那就不必这样麻烦了。真希望所有的标记物都像PEG那样简单。

即标记时可以采用的pH范围比较宽。此类标记物的特点是其等电点的范围很宽。主要是通过碱性氨基酸残基的正电性与胶体金的负电性相吸引，此类物质典型的如HBsAg。如果想偷懒的话，制备好胶体金后，可以直接将HBsAg扔到里面，就能得到良好的标记结果。不偷懒的话，可以调节pH，这样，标记的批间差可能小一些，pH从5到10都可以。任谁喜欢这样听话乖巧的原料。

第三类为pH严格依赖型，

即最好的标记效果是pH=pI+0.5.这样的原料可是大家最最常见的，在标记前需要选择最佳pH。

一般来说，pH非依赖型&pH非严格依赖型的原料标记后因pH的变化而解离的几率不是很大，尤其是pH非依赖型。前提是不能让那些标记后的胶体金处于极其苛刻的pH环境之下的。

pH严格依赖型的原料根据对环境pH的变化有可以分成两类：

第一类是结合后如果环境的pH高于其等电点，标记物很容易与胶体金解离。如果您再加入盐，您会看到胶体金会变成紫色-蓝色。此类标记物静电相互作用要大于疏水相互作用，其分子量一般相对小。（这也是毒品小分子为啥不标记完全抗原的原因之一）。因此，其胶体金稀释液的pH要与标记时的一致，其它缓冲体系最好也如此。

第二类是结合后如果环境的pH高于其等电点，标记物一般不会与胶体金解离。

深层次地，为什么盐离子能造成胶体金的聚沉，也就是我们常说的“死金”？这是由于高盐离子自身电解，会影响胶体金表面的水化层的厚度，随着盐离子浓度的增加，胶体金表面的水化层逐渐被削弱，直至水化层厚度相对于胶体金球粒径极薄，即相对水化层厚度极低不足以维持胶体金的稳定，最终造成胶体金的聚沉。

如果加入盐，胶体金仍然能保持一颗红心不变的。此类标记物疏水相互作用/配位键>静电斥力，其分子量一般比较大，如抗体。这样的标记，缓冲体系也比较好选。

按照常规的方法，最低稳定量+10-20%是好的，但最好做一下功能性实验（灵敏度，稳定性），可能会发现再多加一些蛋白，如抗体，其灵敏度和稳定性会更好一些。这是因为在浓度高的情况下标记，抗体倾向于利用Fc片段与胶体金结合，这样就有较多Fab片段处于游离状态。就如在拥挤的情况下，人也会尽量将脖子伸的更长。

众所周知，标记物是通过三个作用力与胶体金相结合的，一是静电引力，二是疏水相互作用，三是配位键。对蛋白而言，调节标记pH的主要目的是使其包含在内部的疏水性氨基酸残基暴露，而不是刻意使蛋白带正点荷。

在pH=pI+0.5的条件下，蛋白整体上是呈负电性的，只是其碱性氨基酸残基为正电性。

在最适的标记条件下，如果标记物的硫原子很少，对大分子而言，结合力是以疏水作用为主的；对小分子而言，结合力可能是静电引力为主，也可能以疏水作用为主的；如果标记物的硫原子很多，那肯定的配位键是主角，因为配位键的作用力最牛了。

配位键可以用来牢牢固定一些难标记的物质，如某些分子量小，疏水性氨基酸残基少的蛋白，这几乎相当与共价结合了。

如通过巯基化，您还可以将一些小分子的抗原与胶体金标记。另外，通过加入巯基化的封闭剂，您可以大大增加胶体金结合物的稳定性。有的采用此方法封闭，胶体金结合物在两年内活性几乎没有下降。

但万一标记物中的硫原子过多，配位键又很容易在胶体金之间起到桥联的作用，而使胶体金相互凝集。在一些情况下，即使您将标记的pH调节到12以上，胶体金仍然会凝集的。

最后一点，标记物是结合在胶体金二十面体的棱角上的，而不是棱角上所围成的面上，可能与我们想象的有一点点差异。

来源：IVD分享库

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