▲ 图1:扩增曲线。

注：指数期内，每个循环PCR产物量大约增加1倍，该阶段的扩增反应具有高度特异性和精确度。

▲ 图2:标准曲线。

PCR的效率取决于许多因素，包括以下方面：

1）检测的性能。这取决于引物、模板的序列和结构。二级结构和分子间的相互作用都会降低PCR效率。

2）样品基质。其中可能含有来自样品的抑制剂和其他干扰物质，或携带来自上游加工步骤的试剂。检测样品是否有抑制作用，可使用RNA或DNA Spikes方法进行检测，或者通过倍比稀释得到标准曲线也可以观察到。

3）所用试剂及其浓度。本质上，任何PCR试剂都会一定程度上限制PCR反应速率和性能。

4）竞争性反应。多重反应时，各基因的扩增存在反应成分的竞争。

5）qPCR仪器。由于仪器特定的硬件/软件属性和设置、以及用于提取Cq值的特定算法不同，相同的实验中，不同的仪器会产生不同的PCR效率。

6）技术重复。一般进行3次以上的技术重复以校正实验误差，重复数越多精确度越高。

7）连续稀释中的移液体积。移液体积越大，移液器误差或操作误差引起的影响越小。

可能存在的原因：

☑ 移液器校准不良或移液技术差。

☑ 不正确的稀释导致标准曲线出现错误。

☑ 染料浓度低荧光弱或者仪器未校准染料。

☑ 引物设计不好或扩增子具有二级结构。

☑ 标准曲线动态范围太小。

☑ Taq酶无活性或活性降低。

☑ 样品抑制。

2）过高的扩增效率（> 110％）

▲ 图4:标准曲线 E＞110%。

可能存在的原因：

☑ 移液器校准不良或移液技术差。

☑ 不正确的稀释导致标准曲线出现错误。

☑ 引物二聚体或非特异性扩增。

☑ 标准曲线动态范围太小。